多聚磷酸酶調控肌肉蛋白質凝膠特性的研究
多聚磷酸鹽是肉制品加工中常用的添加劑,它們可以改變肌肉的離子強度和pH,可以與蛋白的相互作用,解離肌動球蛋白復合物,多聚磷酸批發廠家增加蛋白質表面的凈電荷數,改善肉或肉制品的保水性、嫩度和適口性。然而添加到肉中的多聚磷酸鹽會在肉中多聚磷酸酶的作用下不斷水解,其中焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽主要通過焦磷酸酶(PPase)和三聚磷酸酶(TPPase)降解。本研究以豬背最長肌為實驗材料,首先,分離純化PPase和TPPase并其酶學特性進行研究。其次,利用免試劑離子色譜技術觀測焦磷酸鈉(TSPP)、三聚磷酸鈉(STPP)及其復合物在純化后PPase或/和TPPase的作用下多聚磷酸鹽的量變和分子形態的動態變化。最后,研究TSPP, STPP和磷酸鹽混合物在不同水解時段對肌肉勻漿物溶解性、流變特性和凝膠特性的影響。具體研究結果如下： 1焦磷酸酶的分離純化與酶學特性研究 通過超速離心、硫酸銨分級沉淀和陰離子交換層析,從豬背最長肌中分離純化出PPase。PPase在非變性電泳和變性電泳圖譜上均呈現單一蛋白條帶。PPase活性為0.43μmol·mg-1 protein·min-1,純化倍數30.7,酶活回收率8%。PPase的底物專一性很強。但在反應體系內底物(TSPP)濃度超過3 mmolL-1時,將會抑PPase的活性。PPase最適反應溫度和pH值分別為50℃和7.5。Mg2+是PPase必需金屬離子,在4.75 mmol·L-1濃度時,對酶激活作用最強。Ca2+卻酶的活性,NaCl和KCl均會酶的活性,NaCl的效應強于KCl。EDTA-Na2和EDTA-Na4在高濃度時對酶活有較強的作用。1mmol·L-1NaF可以完全酶的活性。PPase水解TSPP的動力學參數Km為0.36mmol·L-1PP, Vmax為0.086μmolPi·mg-1 protein·min-1。 2三聚磷酸酶的分離純化與酶學特性研究 通過超速離心、分級沉淀和DEAE-52交換層析,從豬背最長肌中分離純化出TPPase。證實三聚磷酸酶是肌球蛋白。TPPase純化倍數4.12,回收率5.65%。TPPase的最適反應溫度和pH值分別為40℃和6.0,Mg2+、Ca2+對TPPase均有激活作用,分別在0.5 mmolL-1和2.0 mmol·L-1濃度時使酶活達到最大。PP是TPPase的競爭性劑,PP添加濃度達到4 mol·-1時,相對酶活僅剩7.88%。鹽離子NaCl和KCl對純化后肌球蛋白TPPase均有作用,KCl的效應強于NaCl。EDTA-Na2和KIO3對酶活均有作用,Mg2+可以解除EDTA-Na2的效用。TPPase水解TPP的動力學參數Vmax為0.049μmol Pi·mg-1 protein·min-1, Km為0.37mmol·L-1TPP。 3多聚磷酸鹽在純化酶系統中水解的定量分析 利用免試劑離子色譜法測定多聚磷酸鹽在純化酶系統中水解變化。PP在PPase的作用下直接被水解成正磷酸鹽(Pi),50min水解完畢。STPP水解分為兩步,首先被水解PP和Pi,其次生成的PP被進一步水解成Pi。STPP在單一STPPase作用下水解非常緩慢,30 h僅有0.0376g·L-1STPP被水解,派生的TSPP的量一直在增加。而在PPase和STPPase共同作用下,水解過程中派生的TSPP會被迅速水解,沒有任何積累,STPP在30h可以完全水解。信息來源：m.jlbio.net | 發布時間：2021年06月15日
在TPPase作用下STPP和TSPP共存時,STPP水解更加緩慢,30 h僅有0.0111g·L-1 STPP被水解,TSPP在此水解期間不僅沒有下降還上升了0.0065 g·L-1。TPPase和PPase共同作用于STPP、TSPP和HMP的混合物時(TSPP/STPP/HMP=1:1:1), STPP水解速率慢于TPPase和PPase共同作用STPP時。HMP水解比較緩慢,30 h還有大量未水解。研究證實肌球蛋白幾乎沒有焦磷酸酶活性,多聚磷酸鹽以混合形式添加時其各組分總體水解速率會變慢,主要原因是TSPP會STPP水解。 4多聚磷酸鹽水解對豬肉勻漿物流變特性和凝膠特性的影響 TSPP、STPP、磷酸鹽混合物A (TSPP/STPP/HMP=2:5:2)和磷酸鹽混合物B(TSPP/STPP/HMP= 5:2:2)的添加可以提高肌肉勻漿物蛋白質溶解度,降低蛋白濁度。多聚磷酸鹽的添加可以有效提高肌肉蛋白凝膠過程中最終貯能模量G'值。多聚磷酸酶劑EDTA-Na2的添加能延緩TSPP和STPP的水解,從而提高肌肉蛋白質凝膠強度和凝膠保水性。單獨添加0.1%的TSPP或STPP時,肌肉凝膠的保水性在24 h時會出現下降趨勢,而等量混合磷酸鹽添加后在24 h時的凝膠保水性不會下降。說明磷酸鹽以混合的形式添加凝膠的保水性比較好,且穩定性比較好,其中磷酸鹽混合物B保水性好。多聚磷酸鹽對凝膠強度影響的主次順序是：磷酸鹽混合物A STPPTSPP磷酸鹽混合物B。多聚磷酸鹽的添加對凝膠彈性影響不大。
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